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Propiedades de las proteinas || Protienas sustancias recuperadoras ||

Introducción

Las proteínas son macromoléculas compuestas por unidades de alfa –aminoácidos que se unen entre sí mediante enlaces petídicos y que alcanzan un peso molecular igual o superior a 5000 D.

El enlace peptídico, característico de estos compuestos, resulta de la reacción del grupo carboxilo de un aminoácido con el grupo amino del otro aminoácido, lo cual da lugar a un enlace covalente de tipo carbamida y que tiene algunas características peculiares como:

El enlace C-N tiene cierto carácter de doble enlace, por lo cual le confiere rigidez a la molécula.
El oxigeno y el nitrógeno quedan en posición trans.
Todos los elementos que lo componen el enlace se encuentran ubicados en el mismo plano .
La rotación de la molécula formada queda restringida a los carbonos alfa.

El gran número de aminoácidos que componen la molécula proteica determina que su estructura sea extraordinariamente compleja, y que para poder estudiarla nos veamos precisados a dividirla artificialmente en los llamados <<niveles de organización de la estructura proteica >>, de los cuales se describen habitualmente 4, aunque algunos autores llegan a describir 5 o más.

Por supuesto que toda organización estructural que implique determinado orden requiere de la presencia de una fuerza estabilizadora, que en el caso de las proteínas estaría constituida por diferentes tipos de enlaces o interacciones físicas y químicas que se enuncian en el cuadro siguiente:

Nivel de organización	Enlaces que lo mantienen
Primario	Enlace peptídico.
Secundario	Puentes de hidrógeno entre los elementos del enlace peptídico.
Terciario	Puentes de hidrógeno entre las cadenas laterales de los aminoácidos, interacción hidrofóbica, interacción electrostática, puentes disulfuro, enlace éster.
Cuaternario	Los mismos que para el nivel terciario más las fuerzas de Van der Walls.

La complejidad estructural de las proteínas se manifiesta desde el punto de vista funcional en una gran diversidad de funciones biológicas.

Parte experimental

Experimento N° 1:

· Estudiar la propiedad amortiguadora del pH de las proteínas (suero sanguieno).

Método:

· Titulación con ácido en presencia de indicador que vira entre limites donde se supone que existe propiedad amortiguadora.

REACTIVOS:

- Acido clorhídrico 0.01 N

- Solución indicadora de Rojo de Metilo. Vira de rojo (pH 4.2) a amarillo (pH 6.3).

Procedimiento:

· Titular un volumen de suero sanguíneo diluido agregando agua destilada y comparar con la titulación de un suero desproteinado.

· La muestra de suero desproteinado: tomar una muestra de suero sanguíneo y llevarlo a baño de ebullición durante 1 a 2 minutos, agregarle suficiente agua para tener igual dilución que en el suero.

· Filtrar o centrifugar.

Experimento N° 2:

· Determinar el punto isoeléctrico de una proteína (caseína).

Método:

· Estudio de la solubilidad de la caseína a diferentes pH.

REACTIVOS:

- Acido acético 1 N.

- Hidróxido de sodio 1 N

- Solución de caseína en acetato de sodio 0.1 N.

Procedimiento:

· Marcar nueve tubos. En el tubo uno colocar 3.2 ml de ácido acético 1 N y 6.8 ml de agua destilada, mezclar.

· Medir 5 ml de agua destilada a los restantes 8 tubos restantes.

· Sacar 5 ml de la solución del tubo 1 y traspasarlo al tubo 2 y mezclar; así sucesivamente hasta el ultimo tubo el cual se elimina los 5 ml que se saquen del tubo 9.

· Agregar 1 ml de caseína a los nueve tubos, mezclar al instante .

· Anotar el efecto que se produce al instante y el de los 30 minutos después en cada tubo.

Experimento N° 3:

· Estudiar la precipitabilidad de las proteínas por solventes orgánicos.

· Estudiar el efecto de la temperatura sobre la desnaturación de las proteínas en presencia de solventes orgánicos.

Método:

· Precipitación y redisolución de las proteínas sericas.

REACTIVOS:

- Etanol de 95°( 10% a 100%)

- Cloruro de sodio 0.15 M

- Agua destilada (de acuerdo al porcentaje de alcohol que se use)

- suero sanguíneo (0.5 ml de suero sanguíneo).

Procedimiento:

· Tomar 2 muestra de suero sanguíneo(4 muestras divididas en cuatro tubos).

· Agregar a una de ellas 3 volúmenes de etanol de 95° equilibrando a temperatura ambiente. A la otra agregar etanol a de 95° equilibrando a la temperatura de una mezcla frigorífica (hielo) –10° C aproximadamente.

· Diluir 1: 4 cada muestra con solución de NaCl 0.15 M. Levar a temperatura ambiente.

· Variar las condiciones del experiemnto: volumen de etanol, temperatura, tiempo de incubación, cantidad y composición del diluyente final.

Experimento N° 4:

· Determinar la acción de cationes y aniones sobre la solubilidad de las proteínas.

Método:

· Precipitación y redisolución de las proteínas con ácido y base.

REACTIVOS:

- HCl 0.1n.

- NaOH 0.1 n

- Acetato de plomo 10%

- Sulfato de zinc 10%

- Tungstato de sodio 10%

- Ferrocianuro de potasio 10%

- Albúmina 1.5 ml

Preparación:

· Enumere 8 tubos .

· Seleccionar los primeros 4 tubos agregandoles 1.0 ml HCl y a los restantes 4 tubos añadir 1.0 ml de NaOH , al principio en medio ácido y en medio básico.

· Agregar 1.5 ml de Albúmina a todos los tubos.

· Una vez preparados los tubos de ensayo, estudiar el efecto de cada una de las sales indicadas en reactivos, sobre la solubilidad de las proteínas en ambiente ácido como básico.

Resultados y Conclusión

Registro N°1:

· Indicar en cada caso los meq de ácido gastado para cambiar aproximadamente 1 unidad de pH por ml de suero sanguíneo.

Resultados :

· En el tubo 1, con proteínas: suero (1 ml) más agua destilada (5 ml). Luego al mezclar la solución se le agrega el indicador de rojo de metilo 10 gotas, cuya mezcla se torna de color amarillo. Se titula con HCl 0.01 N hasta cambiar a un color rosado pálido gastando 14 ml de aquel ácido.

· En el tubo 2, sin proteínas: suero (1ml) a baño de ebullición de 1 a 2 min, formándose un precipitado amarillo débil. Se le añade 5 ml de agua destilada. Luego se procede a moler el precipitado; se agrega 10 gotas del indicador rojo de metilo cambiando la mezcla de un color amarillo. Se titula con HCl 0.01 N gastando 7 ml y virando a un color rojizo.

· En el tubo 3, desproteinado: suero (1 ml) a baño de ebullición de 1 a 2 min, formando un precipitado amarillo débil. Se añade 5 ml de agua destilada. Se muele el precipitado y se filtra. A la mezcla filtrada (incolora) se le añade 10 gotas de rojo de metilo obteniendo un color amarillo. Se titula con HCl 0.01 N con un gasto de 2.8 ml.

Cálculos:

Datos N°1: 14 ml HCl gastados al titular con una concentración del ácido de 0.01 N.

N * 14 ml = 0.14 meq

Además:

0.14 meq 2.1 pH

x meq 1.0 pH/

x = 0,066 meq.

2. Datos N°2: 7 ml HCl gastados al titular con una concentración de ácido de 0.01 N

N * 7 ml = 0.07 meq

Además:

0.07 meq 2.1 pH

x meq 1.0 pH/

x = 0,0033 meq.

3. Datos N°3: 2.8 ml HCl gastados al titular con una concentracion de ácido de 0.01 N

N * 2.8 ml = 0.028 meq

Además:

0.028 meq 2.1 pH

x meq 1.0 pH/

x = 0,013 meq.

Conclusión:

Cuando la temperatura es elevada aumenta la energía cinética de las moléculas con lo que se desorganizan la envoltura acuosa de las proteínas, y se desnaturalizan. Lo que significa que el interior hidrofóbico interacciona con el medio acuosos y se produce la agregación y la precipitación de la proteína desnaturalizada.

Una proteína puede adoptar diferentes conformaciones dependiendo de la temperatura y de los hidrogeniones que están en solución. Por eso, si cambiamos la concentración de hidrogeniones, es decir, el pH de la solución, la proteína puede adoptar una conformación no funcional y puede conducir a patologías y aun la muerte. De aquí que sea absolutamente necesario mantener el pH intra y extracelular de los seres vivos dentro de unos limites muy estrechos de pH.

El pH de la sangre, por ejemplo, es de 7.4. si baja por debajo de 7.2 se tiene una condición llamada ACIDOSIS. Si sube por encima de 7.6 tendremos ALACALOSIS.

Para mantener el pH de los líquidos corporales constante hacemos uso de sistemas que llamamos amortiguadores (inglés, buffer; francés, tampón), los cuales en este caso las proteínas son buenos amortiguadores por que los aminoácidos que lo constituyen se comportan como ácidos débiles .

Respecto al gasto realizado con HCl al titular se deduce que mientras más estabilizada y estructurada esta la proteína mayor cantidad de volumen se requiere para lograr varia el pH de la solución cumpliendo así la propiedad amortiguadora que poseen las proteínas. En cambio cuando se desnaturaliza la proteína el gasto de HCl es mucho menor debido a que no alcanza mantener el pH constante.

Registro N°2:

· Calcular el pH de las soluciones en cada tubo mediante la ecuación de Henderson-Hasselbalch Siendo el pk del CH₃COOH = 4,7.

· Evaluar la solubilidad de la caseína en función del precipitado formado y la turbidez de la solución.

· Indicar el pI aproximado así obtenido.

Cálculos:

3,2 ml de ácido acético 1 N; 6,8 ml de agua destilada, cada traspaso de un tubo a otro se divide éste en ácido por la mitad.

Ecuación de Henderson-Hasselbalch pH = pK + log [caseína]

[CH₃COOH]

pK = 4.7

Tubos	[CH₃COOH] = meq [1 N]	[caseína] = meq [0.1 N]	PH
Uno	1.6 ml * 1 N =1.6 meq	1 ml * 0.1 N= 0.1 meq	3.5
Dos	0.8 ml * 1 N = 0.8 meq	1 ml * 0.1 N = 0.1 meq	3.8
Tres	0.4 ml * 1 N = 0.4 meq	1 ml * 0.1 N = 0.1 meq	4.1
Cuatro	0.2 ml * 1 N = 0.2 meq	1 ml * 0.1 N = 0.1 meq	4.4
Cinco	0.1 ml * 1 N = 0.1 meq	1 ml * 0.1 N = 0.1 meq	4.7
Seis	0.05 ml * 1 N = 0.05 meq	1 ml * 0.1 N = 0.1 meq	5.0
Siete	0.025 ml * 1 N = 0.025 meq	1 ml * 0.1 N = 0.1 meq	5.3
Ocho	0.0125 ml * 1 N = 0.0125 meq	1 ml * 0.1 N = 0.1 meq	5.6
Nueve	0.00625 ml * 1 N = 0.00625 meq	1 ml * 0.1 N = 0.1 meq	5.9

Resultados :

· En el tubo 1: solución transparente

· En el tubo 2: " color blanco espeso a medio notar

· En el tubo 3: " blanco espeso

· En el tubo 4: " mezcla con principio de formación de precipitado

· En el tubo 5: " mezcla con precipitado

· En el tubo 6: " mezcla con precipitado

· En el tubo 7: " blanco

· En el tubo 8: " incoloro

· En el tubo 9: " incoloro

Conclusión:

Cuando el pH es bajo, los grupos ionizables está protonado, y la carga neta de la proteína es de signo positivo. Cuando el pH es alto, los grupos ionizables está desprotonado, y la carga neta es de signo negativo. Entre amabas zonas, habrá un pH en el cual la carga neta de la proteína es nula. Es el pH isoeléctrico o punto isoeléctrico, y es característico de cada proteína. La solubilidad de una proteína es mínima en su punto isoeléctrico, ya que su carga neta es cero y desaparece cualquier fuerza de repulsión electrostática que pudiera dificultar la formación de agregados. El punto isoeléctrico de la caseína es de 4,6 – 4,7.

Registro N°3:

· Anotar el efecto del etanol sobre la solubilidad y desnaturación (puesto en evidencia por la coagulación) de las proteínas del suero sanguíneo a las temperaturas elegidas.

Resultados:

· Alcohol al 60% a temperatura ambiente: afecto mucho, mezcla lechosa, proteína desnaturalizada.

· Alcohol al 60% a temperatura fría: mezcla amarilla transparente

· Alcohol al 100% a temperatura ambiente: amarillo, no cambió tanto

· Alcohol al 100% a temperatura fría: mezcla espesa con precipitado pequeño

La concentración de alcohol de un 10 a 100% a temperatura ambiente

Como al 40% posiblemente habría una formación de precipitado, y por tanto, aumenta la insolubilidad al tratar de recuperar la constante dieléctrica asimismo aumenta la interacción de las moléculas de las proteínas contribuyendo a la formación de la precipitación.

La concentración de alcohol de un 10 a 100% a temperatura fría

Casi al 100% se pudo recuperar la proteína al bajar la temperatura, aumentando así la solubilidad entre las proteínas y los solventes orgánicos.

Conclusión:

La polaridad del disolvente disminuye cuando se le añaden sustancias menos polares que el agua como etanol o la acetona. Con ello disminuye el grado de hidratación de los grupos ionicos superficiales de la molécula proteica, provocando la agregación y precipitación. Los disolventes orgánicos interaccionan con el interior hidrofóbico de las proteínas, y desorganizan la estructura terciaria, provocando su desnaturalización y precipitación.

Registro N°4:

· Evaluar la solubilidad de las proteínas en cada condición eperimental.

Resultados:

Albúmina 1.5 ml

Tubo 1

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

Tubo 5

Tubo 6

Tubo 7

Tubo 8

1.5 ml

Inicio cationes	Medio ácido 1.0 ml HCl 0.1 N a los primeros Cuatro tubos				Medio básico 1.0 ml NaOH 0.1 N a los restantes cuatro tubos
Zn	-				+
Na		+				-
K			+				-
Pb				-				+
fin cationes	Medio básico 1.5 ml NaOH 0.1 N a los primeros cuatro tubos				Medio ácido 1.5 ml HCL 0.1 N a los restantes cuatro tubos
Zn	+				-
Na		-				+
K			-				+
Pb				+				-

Conclusión:

El zinc forma un precipitado en medio básico.

El sodio forma un precipitado en medio ácido.

El potasio forma un precipitado en medio ácido.

El plomo forma un precipitado en medio básico.

Las proteínas pueden precipitar con la adicion de cationes como el Zn ⁺²y el Pb ^{+2 .}

Estas proteínas pueden precipitar mediante un agente precipitante de carga opuesta a la de las proteínas; esto se requiere que el pH de la solución debe ser controlado de tal modo que la proteína quede en el lado ácido o básico de su punto isoeléctrico.

Anexo

Sangre: es un liquido rojo, viscoso de sabor salado y olor especial. En ella se distinguen las siguientes partes = el plasma, los glóbulos rojos, los glóbulos blancos y las plaquetas.

Plasma sanguíneo: es la parte liquida, es salado de color amarillento y en él flotan los demás componentes de la sangre, también lleva los alimentos y las sustancias de desecho recogidas de las células. El plasma sanguíneo cuando se coagula la sangre, origina el suero sanguíneo.

Suero sanguíneo: al liquido resultante tras la coagulación de la sangre. Se define como la parte liquida del plasma sanguíneo. El suero sanguíneo contiene en solución albúminas, globulina, sales, enzimas, hormonas, vitaminas, lípidos, hidratos de carbono, aminoácidos, etc.

El suero: se define como la parte clara de un liquido orgánico (referido casi siempre a la sangre) que queda después de su coagulación.

Los glóbulos rojos o hematies: tienen forma de discos bicóncavos y son tan pequeños que en cada milímetro cúbico hay cuatro a cinco millones, miden unas siete micras de diámetro, no tiene núcleo por eso se consideran células muertas, tiene un pigmento rojizo llamado HEMOGLOBINA que les sirve para transportar el oxígeno desde los pulmones a las células.

Los glóbulos blancos o leucocitos: son mayores pero menos numerosos (unos siete mil por milímetro cúbico), son células vivas que se trasladan, se salen de los capilares y se dedican a destruir los microbios y células muertas que encuentran por el organismo. También producen antitoxinas que neutralizan l0os venenos de los microorganismos que producen las enfermedades.

Las plaquetas: son células muy pequeñas, sirven para taponar las heridas y evitar hemorragias.

Bibliografía

· Guía de laboratorio de Bioquimica

· Páginas en internet.

· http://www.inicia.es/de/proteoma/aminoacidos.htm

· http://caminantes.metropoliglobal.com/web/biologia/aminoacidos.htm

· http://www.um.es/~molecula/prot03.htm

· H.-D. Belitz * W. Grosch : Quimica de los alimentos; sedunda edición.

Universidad de la Serena

Facultad de Ingeniería

Escuela de Ing. En Alimentos/

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